Centro de Documentação da PJ
Monografia
 CD184 |
DNA barcoding and forensic entomology [Documento electrónico] : a molecular approach for Diptera species' identification / Eva Sofia Alves Rolo.- [Lisboa] : [s.n.], 2010.- 1 CD-ROM ; 12 cm
Mestrado em Biologia Humana e Ambiente - Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa - tendo como orientadoras as Professoras Doutoras Deodália Dias e Mª Teresa Rebelo. Resumo inserto no próprio documento. Ficheiro de 12,7 Mb em formato pdf (87 p.). Disponível também através de: http://repositorio.ul.pt/handle/10451/2024. Acedido a 15 de maio de 2012.
ENTOMOLOGIA FORENSE, GENÉTICA, BASE DE DADOS, BIOLOGIA, TESE, PORTUGAL
A Entomologia Forense é a ciência que aplica o conhecimento sobre os insectos, e outros artrópodes, em procedimentos jurídico-legais. O primeiro passo a ser tomado em Entomologia Forense é a identificação das espécies, normalmente realizada através de caracteres morfométricos, utilizando chaves dicotómicas de identificação; no entanto, a observação da morfologia é um método, por vezes, demorado e inconclusivo. Por outro lado, os métodos moleculares fornecem uma identificação rápida e precisa, possibilitam a identificação dos insectos em qualquer estádio de desenvolvimento, incluindo os estádios larvares, e podem ser utilizados independentemente das condições de preservação dos exemplares. Na verdade, as metodologias para identificação molecular de espécies têm sofrido uma grande evolução e, actualmente, o “DNA barcoding” é considerado uma ferramenta muito útil na identificação de espécies. Este conceito baseia-se na amplificação e sequenciação de um pequeno segmento de ADN – conhecido como sequência barcode - de uma região padrão do genoma. Vários estudos sugerem o uso da sequência que codifica para a subunidade I da proteína citocromo c oxidase (COI) como o marcador de DNA adequado para o “DNA barcoding”. A identificação de espécies através desta nova ferramenta baseia-se na amplificação e sequenciação deste fragmento; uma vez obtida a informação da sequência do espécime-alvo é possível compará-la com sequências de referência, isto é, sequências de espécies previamente identificadas, já existentes numa biblioteca digital. A identificação de espécies através do “DNA barcoding” implica, numa análise filogenética, que cada espécie surja como um grupo monofilético. Apesar, deste novo conceito se basear no uso de métodos de construção de árvores filogenéticas, não deve ser interpretado como tal, uma vez que a sequência “barcode” não apresenta, frequentemente, um sinal filogenético suficiente para determinar relações evolutivas. Um outro critério para a delineação de espécies assenta em valores limite para as divergências nucleotídicas intra e interespecíficas. Um dos limites é de 3% (valor estabelecido para insectos), em que valores de divergência intra-específica abaixo deste limite determinam uma única espécie e valores de divergência interespecíficas acima, apontam para diferentes espécies. O outro limite, que surge como uma actualização do primeiro, sugere que a média da divergência nucleotídica entre espécies pertencentes ao mesmo género deve ser 10 vezes superior à média da divergência intra-específica encontrada para as mesmas espécies. A observação destes três critérios permite, assim, determinar se estamos perante a mesma espécie ou espécies diferentes. O “Barcode of Life Data System” (BOLD) é um “software” responsável pela gestão de dados obtidos através da ferramenta “DNA barcoding”. O sistema de identificação do BOLD é a unidade funcional para a identificação de espécimes no qual, a sequência obtida é submetida e comparada com as sequências referência, à semelhança dos sistemas utilizados noutros bancos de dados para a identificação de espécies (por exemplo, a base de dados GenBank do “National Center for Biotechnology Information” NCBI). A existência de evidências entomológicas pode ser de grande importância para casos forenses. De facto, estas podem fornecer informações importantes que poderão orientar o decorrer da investigação criminal. A criação e implementação de uma Base de Dados de espécies de insectos é um passo importante para a Entomologia Forense. Com efeito, qualquer país que possua um serviço de Entomologia Forense eficaz e cientificamente bem suportado deve ter um conhecimento abrangente da diversidade de insectos. O uso do “DNA barcoding” sugere a sua utilidade na identificação de espécies de insectos encontrados em cenários forense. Apesar das vantagens científicas e pragmáticas existentes no conhecimento da diversidade de insectos em qualquer região do globo, a utilização deste marcador genético em bancos de dados exige que seja determinada a sua eficácia na distinção entre espécies. Este estudo foi desenvolvido e escrito com vista à preparação de dois artigos científicos que serão submetidos a revistas internacionais da especialidade. Neste sentido, a presente dissertação está dividida em quatro partes. O Capítulo 1 refere-se à Introdução geral que assenta na revisão bibliográfica e estado de arte sobre a Entomologia Forense e do “DNA barcoding”, e que dá o fundamento ao trabalho desenvolvido. O Capítulo 2 diz respeito ao primeiro artigo científico que tem como título “Cytochrome c oxidase I effectiveness as a marker for insects’ identification”. Este capítulo tem como principais objectivos determinar as sequências correspondentes à região do gene COI, de cada espécime, utilizada para efeitos de “DNA barcoding”, isto é, um fragmento de 658 pares de bases correspondente à região inicial do gene COI e, testar a eficácia deste para a identificação de espécies de dípteros com relevância forense. Aqui foram utilizados 52 indivíduos pertencentes a quatro espécies de Diptera, “Calliphora vicina” (Robineau- Desvoidy, 1830), “Calliphora vomitória” (Linnaeus, 1758), “Lucilia caesar” (Linnaeus, 1758) e “Musca autumnalis” (De Geer, 1776). Estes espécimes foram recolhidos e morfologicamente identificados num estudo desenvolvido anteriormente. A amplificação, com “primers” universais, e a sequenciação da região em estudo foram facilmente obtidas. Este facto é muito vantajoso em situações que necessitam de uma maior rapidez na análise das amostras, como acontece em situações de contexto forense. O estudo filogenético permitiu identificar cada espécie como um grupo monofilético. Por sua vez, a análise das divergências nucleotídicas intra e interespecíficas, para as duas espécies do mesmo género, permitiram confirmar que, para os dois limites utilizados para a identificação de espécies através do “DNA barcoding”, estas são espécies diferentes. Estes resultados mostram a eficácia do COI como marcador genético para a discriminação de espécies. O Capítulo 3 refere-se ao segundo artigo científico, e tem como título “Forensic relevant insects’ identification through GenBank and BOLD databases”. O principal objectivo deste trabalho foi determinar a capacidade destas bases de dados públicas para a identificação de espécies de insectos com interesse forense. Além disso, os dados foram também utilizados para determinar a eficácia do marcador COI. Como anteriormente, todas as amostras foram facilmente amplificadas e sequenciadas. Os resultados mostraram que foi possível identificar 67.6% dos indivíduos, ao nível da espécie através da base de dados GenBank. Através da base de dados BOLD foi possível identificar 58.8% dos espécimes, também ao nível da espécie. No total foram identificados 49 espécimes pertencentes a 11 espécies diferentes: “Eudasyphora cyanella” (Meigen, 1826), “Lucilia caesa”r (Linnaeus, 1758), Pollenia rudis (Fabricius, 1794), “Musca Autumnalis” (De Geer, 1776), “Phaonia subventa” (Harris, 1780), “Phaonia Tuguriorum” (Scopoli, 1763), “Helina impucta” (Fallén, 1825), “Helina evecta” (Harris, 1780), “Helina reversio” (Harris, 1780), “Hydrotaea dentipes” (Fabricius, 1805) e “Hydrotaea armipes” (Fallén, 1825). As sequências correspondentes a estas amostras foram utilizadas, posteriormente, para a análise filogenética e para o cálculo das divergências nucleotídicas intra e interespecíficas. Na análise filogenética foi possível observar situações de monofilia para todas as espécies. No que diz respeito à avaliação das divergências nucleotídicas entre espécies do mesmo género, os valores limite possibilitaram a discriminação de cada espécie. Em suma, estes resultados corroboraram a eficácia do gene COI para identificação de espécies. Por fim, o Capítulo 4 destina-se às considerações finais, onde é referida a importância deste trabalho para a aplicação do marcador COI em bases de dados, utilizadas não só em situações de contexto forense mas também para o conhecimento global da diversidade biológica bem como a sua importância para a contribuição de uma base de dados da biodiversidade nacional.